PKR的dsRBD能夠與5′端三磷酸 的單鏈RNA結合并引起PKR的活化,但其研究并沒 有排除這種結合是否有鏈接區的參與 。MAYO 等最新研究認為,PKR與單鏈RNA的結合是由于 鏈接區有一段富含堿性氨基酸的 Basic Region 的作 用。富含堿性氨基酸的區域帶較多正電荷,能夠與 單鏈 RNA 帶負電荷的磷酸基團結合,并由此促進 KD的二聚化和活化。Taq DNA 聚合酶、Prime? star DNA 聚合酶、dNTP、限制性內切酶(Xho I 和 EcoR I)、DL2000 Marker 購于 TaKaRa 公司;瓊脂糖 (Agarose)、無水乙醇、異丙醇、DEPC(焦碳酸二乙 酯)均購于上海生工生物工程有限責任公司。RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒均購于 TaKaRa 公司。 美國ABI公司PCR儀、美國Thermo公司微型高速離 心 機 、上 海 博 迅 立 式 壓 力 蒸 汽 滅 菌 器(XQ-LS100G)、蘇州凈化超凈工作臺(SW-CJ-ED)、杭州奧 盛三聯多用途金屬浴、上海天能EPS300電泳儀等。
在斑馬魚基因組內,雖然同時存在等位基因 ZPKRa(基因登錄號:AM421526. 1)和 ZPKRb(基因 登錄號:AM421527. 1),但兩者的核苷酸序列相差很 小,氨基酸序列則只有5個氨基酸的差異,且都不在 關鍵的位點 。除此之外,本研究發現斑馬魚細胞 內 還 同 時 存 在 ZPKR 和 ZPKRV(基 因 登 錄 號 : MH425504. 1)兩種不同結構的PKR的表達,ZPKRV 僅僅在鏈接區缺失28個氨基酸殘基,其中包含缺失 鏈接區內的功能模體堿性區。斑馬魚體內這2種PKR的轉 錄表達,其翻譯表達的產物將在刺激后24 h共存于細 胞內,通過顯性的負效應,可能減弱其PKR上調后對 蛋白翻譯的抑制作用。事實上,qPCR結果顯示, 在Poly I:C刺激后的24 h,ZPKRV表達達到峰值,并 且 ZPKR和 ZPKRV的比值最小,為 3. 08。這時兩者 的相互作用產生的顯性負效應最大,對蛋白翻譯抑制 作用最小。